qPCR引物与探针设计全参数 — Tm/GC含量/二级结构/二聚体/扩增子长度优化

qPCR引物与探针设计参数大全: 一、引物设计规范:长度18~25nt(过短特异性差/过长Tm偏高退火效率低)。Tm值58~62°C(上下游Tm差<2°C)。GC含量40~60%(GC过高二级结构风险/GC过低非特异结合增加)。3'端最后5个碱基GC≤3个(避免3'端强结合→非特异延伸)。避免:连续4个以上相同碱基(如AAAA→测序误差)/自身互补(inverted repeats→二聚体)/引物间互补(3'端重叠→引物二聚体)。Blast验证特异性(人基因组+目标物种基因组)。 二、TaqMan探针规范:长度20~30nt/Tm比引物高8~10°C(确保探针先于引物结合)。5'端报告基团(F...